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试谈侵袭性烟曲霉感染特异性甘露聚糖捕获ELISA和rDNAITS区DNA检测策略的建立及评价-优秀毕业论文网

论文预读:试谈侵袭性烟曲霉感染特异性甘露聚糖捕获ELISA和rDNAITS区DNA检测策略的建立及评价-优秀毕业论文网

摘要:侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis, IA)是一种主要由肺部感染播散至全身多个脏器的系统性感染疾病,是免疫受损人群的主要致死性并发症之一。腐生性丝状真菌烟曲霉(Aspergillus Fumigatus)是引起IA的最主要曲霉物种,这主要是由烟曲霉的孢子性质决定的,烟曲霉的孢子产量非常大,在环境中无处不在,平均每人每天可吸入上百个烟曲霉孢子,同时,其孢子体积小,易发生侵入性感染,且吸附能力强,生长速度快,对不良环境的抵抗力强。对于健康个体,吸入的孢子可及时被清除,但是在某些免疫受损患者群中,吸入的烟曲霉孢子可在肺部萌发、繁殖,引发肺曲霉病。孢子一旦进入血液循环,则可在其它组织器官定植,造成系统性全身感染,即IA。随着免疫抑制剂的使用,器官移植、造血干细胞移植、肿瘤化疗等治疗手段的出现,以及继发件免疫缺陷疾病如AIDS等的出现,导致大量易受烟曲霉感染的免疫缺陷人类宿主出现。对这些免疫缺陷个体,IA的感染率可高达50%。即使采用抗真菌治疗,死亡率也常常有50%之多。早期快速诊断有助于及时实施抗真菌治疗,控制病情,改善预后。然而,在大多数情况下,诊断问题尚不能解决,延误了有效的医学治疗。现阶段,烟曲霉感染的主要诊断方法包括传统诊断、基因检测、特异性抗原抗体检测等。传统的诊断方法主要有影像学、无菌腔液标本培养和组织病理学鉴定等。影像学上的新月征(air crescent)和晕轮征(halo sign),由于类似特征在念珠菌病、军团菌病、巨细胞病毒感染、Kaposi肉瘤等患者体内也可观察到,并不能作为IA确诊的依据。呼吸道分泌物培养诊断敏感性低,而血培养即使在传播性感染中,也多表现为阴性。此外,标本培养还存在培养周期长等缺点。而组织病理学检查具有创伤性,并不适用于所有的患者。因此,传统的诊断方法已难以满足IA诊断的临床需要。IA病情发展迅速,机体并无足够产生抗体的时间,以及免疫受损患者特异性免疫应答水平低的特点,使得抗体检测易出现假阴性结果。同时,每天吸入空气中大量烟曲霉孢子,正常个体机体内所存在的烟曲霉特异抗体,又可导致假阳性结果的出现。因此,单一的特异性抗体检测在IA诊断中的应用价值一直存在争议。近年来,IA的诊断学研究热点主要集中在抗原捕获和基因检测方面。目前被国际认可的具有诊断价值的真菌抗原主要有两种:半乳甘露聚糖抗原(Galactomannan, GM)和(1,3)-p-D葡聚糖抗原(p-D glucan, BG),这两种检测方法已被美国和欧洲许多国家批准用于侵袭性真菌感染诊断中。然而,这两种方法具有敏感性和特异性均不稳定的应有局限性。如GM检验不能区分曲霉菌与马尔尼菲青霉菌的感染,且在病情发展中很快被清除掉,导致出现假阴性结果。BG检测(G试验)没有种属特异性,不能区分曲霉与酵母菌感染,对静脉使用白蛋白或γ球蛋白患者,抗肿瘤药物如香菇菌多糖使用患者,以及粘菌素E、头孢噻肟等抗菌药物使用患者的检测,均存在出现假阳性结果的可能。寻找新的特异性抗原靶标,建立灵敏度和特异性俱佳的抗原捕获检测方法在目前仍显得尤为重要。随着分子生物学技术的广泛应用,烟曲霉临床分离菌株Af293的全基因组测序完成,很多研究工作者把目标转向根据基因组信息设计具有种、属特异性的引物,发展简便、快速的IA诊断方法。尽管基因检测方法要成为诊断IA的常规检测方法还存在很多问题,包括方法学标准化困难,对实验场地的配置、实验操作规范性、对人员的要求高等。基因检测仍具有其它诊断方法不可比拟的优点,包括可准确分类到菌株类型,获得感染物种耐药性等相关信息。因此,建立IA患者烟曲霉特异基因检测标准化方法,有助于实现IA的早期快速精确诊断。由此,本研究的目的主要在于,建立烟曲霉感染特异性抗原捕获ELISA检测方法,同时建立烟曲霉感染基因检测标准化诊断方法,以求最终实现烟曲霉感染的早期诊断。研究内容主要有:1.重组Afmp1p蛋白的毕赤酵母表达,抗rAfmp1p单克隆抗体的制备以及烟曲霉感染特异性Afmplp抗原捕获ELISA方法的建立与评价Afmplp由AFMP1基因所编码,为烟曲霉半乳甘露聚糖蛋白,由本实验室与香港大学袁国勇教授等人合作,于2001年通过生物信息学分析发现。在发现该靶标蛋白后,使用大肠杆菌表达系统表达重组GST-Afmplp融合蛋白,制备抗GST-Afmplp豚鼠血清,使用多克隆抗体(polyclonal antibody, PAb)夹心法,建立了烟曲霉感染抗原捕获ELISA检测方法。然而,该方法对烟曲霉感染IA患者检测的灵敏度仅为5

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