关于浅议乳源金葡菌主要肠毒素基因的检测、表达及其抗体制备-学术论文网

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浅议乳源金葡菌主要肠毒素基因的检测、表达及其抗体制备-学术论文网

论文预读:          摘要3-4Abstract4-9图表目录9-11本论文常用中英文缩写词11-12文献综述12-17引言17-191 材料与方法19-301.1 实验菌株191.2 工程菌与质粒191.3 酶类与主要试剂(盒)191.4 实验动物191.5 主要培养基与溶液的配制19-221.5.1 Baird-Parker 培养基191.5.2 LB 培养基191.5.3 琼脂糖凝胶电泳所需溶液19-201.5.4 制备感受态浅议乳源金葡菌主要肠毒素基因的检测、表达及其抗体制备-学术论文网

摘要:金葡菌肠毒素(Staphylococcal Enterotoxin, SE)是引起人类食物中毒和葡萄球菌胃肠炎的主要原因。SE共有18个基因类型,不同SE基因的检出率与菌株分离地域和宿主来源有关。针对合肥地区乳源金葡菌肠毒素基因型分布状况尚不清楚的现状,本研究在采用PCR方法检测56株合肥分离株10种SE基因,确定其主要基因型的基础上,利用大肠杆菌原核表达系统成功表达了主要肠毒素SEA和SEG蛋白,并制备了其特异性抗体。研究结果为进一步建立金葡菌肠毒素的免疫学检(监)测方法奠定了基础,对保障乳制品的安全,防止SE食物中毒具有一定指导意义。为了明确合肥地区乳源金葡菌肠毒素基因型的分布状况,根据GenBank中收录的各型SE基因序列(SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEM和SEN),设计10对特异性引物,对56株乳源金葡菌合肥分离株进行10种SE基因PCR检测。结果显示56株测试菌中有53株携带SE基因,总携带率为94.64%,各型肠毒素基因的携带率分别为SEA41.07%、SEB16.07%、SEC19.64%、SED3.57%、SEG91.07%、SEH5.36%、SEI17.86%、SEM5.36%和SEN24.43%,未检测到SEE基因。SE阳性菌株可同时携带两种或两种以上的SE基因,共组成49种肠毒素基因型,但以SEA-SEG为其主要肠毒素基因型。结果提示,应建立一种敏感、快速和特异的免疫学方法,加强对合肥地区原料乳中SEA和SEG的检(监)测。为了获得SEA和SEG蛋白检测原和免疫原,根据金葡菌ATCC25923的SEA和SEG基因序列,设计2对特异性引物,PCR扩增出全长SEA基因(774bp)和切除信号肽的SEG基因(702bp)。分别将PCR扩增产物克隆至pAML-c4X质粒,构建出原核表达重组质粒pAML-c4X-SEA和pAML-c4X-SEG。诱导表达的可溶性重组蛋白经亲和层析柱纯化后,得到纯度分别为98.32%和97.69%、浓度分别为1.0mg/mL和1.5mg/mL的重组SEA和SEG蛋白,它们均满足作为检测原和免疫原的要求。为了制备SEA和SEG蛋白检测抗体,将纯化的重组SEA和SEG蛋白分别与双相乳化佐剂充分乳化制成免疫原,分别免疫家兔,二次免疫后第14天抗SEA抗体的ELISA效价和琼扩效价分别高达1:6553600和1:64,抗SEG抗体的ELISA效价和琼扩效价分别高达1:3276800和1:32,它们纯化后均可作为检测抗体使用。 关键词:乳源金葡菌 主要肠毒素基因型 SEA与SEG蛋白 原核表达 抗体
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  • 摘要3-4
  • Abstract4-9
  • 图表目录9-11
  • 本论文常用中英文缩写词11-12
  • 文献综述12-17
  • 引言17-19
  • 1 材料与方法19-30
  • 1.1 实验菌株19
  • 1.2 工程菌与质粒19
  • 1.3 酶类与主要试剂(盒)19
  • 1.4 实验动物19
  • 1.5 主要培养基与溶液的配制19-22
  • 1.5.1 Baird-Parker 培养基19
  • 1.5.2 LB 培养基19
  • 1.5.3 琼脂糖凝胶电泳所需溶液19-20
  • 1.5.4 制备感受态细胞所需溶液20
  • 1.5.5 蛋白电泳检测所需溶液20-21
  • 1.5.6 蛋白诱导表达及提纯所需溶液21
  • 1.5.7 ELISA 实验所需溶液21-22
  • 1.6 主要仪器22
  • 1.7 乳源金葡菌合肥分离株 SE 基因的 PCR 检测22-24
  • 1.7.1 细菌基因组 DNA 提取22-23
  • 1.7.2 引物设计23-24
  • 1.7.3 SE 基因 PCR 扩增条件的优化24
  • 1.8 原核表达重组质粒的构建与鉴定24-27
  • 1.8.1 SEA 与 SEG 基因的 PCR 扩增24
  • 1.8.2 PCR 产物回收纯化与 pMAL-c4X 质粒抽提24-25
  • 1.8.3 PCR 产物与质粒的双酶切25
  • 1.8.4 连接与转化25-26
  • 1.8.5 重组表达质粒的鉴定26-27
  • 1.9 重组融合蛋白的表达与纯化27-28
  • 1.9.1 重组融合蛋白的诱导表达与鉴定27
  • 1.9.2 表达产物的性质分析27-28
  • 1.9.3 重组融合蛋白的大量表达28
  • 1.9.4 重组融合蛋白的纯化28
  • 1.10 SEA 与 SEG 蛋白抗体的制备28-30
  • 1.10.1 免疫原制备28-29
  • 1.10.2 实验兔免疫29
  • 1.1

论文随机片段:ED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEM和SEN),设计10对特异性引物,对56株乳源金葡菌合肥分离株进行10种SE基因PCR检测。结果显示56株测试菌中有53株携带SE基因,总携带率为94.64%,各型肠毒素基因的携带率分别为SEA41.07%、SEB16.07%、SEC19.64%、SED3.57%、SEG91.07%、SEH5.36%、SEI17.86%、SEM5.36%和SEN24.43%,未检测到SEE基因。SE阳