关于试论Slingshot1L磷酸酶在骨肉瘤多药耐药细胞中的表达及其作用-****毕业********

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试论Slingshot1L磷酸酶在骨肉瘤多药耐药细胞中的表达及其作用-****毕业********

论文预读:L在多药耐药细胞MG63/VCR中过表达,同时正向调节着多药耐药基因MDR1及耐药相关基因MRP、抗凋亡基因BCL-2的表达水平。(2)SSH1L对MG63/VCR细胞的迁移没有促进作用,而瘦素对MG63/VCR细胞具有明显的促进迁移作用。(3)SSH1L的表达与骨肉瘤细胞的耐药性具有显著相关性,可能参与调节骨肉瘤的多药耐药。                  关键词:骨肉试论Slingshot1L磷酸酶在骨肉瘤多药耐药细胞中的表达及其作用-****毕业********

摘要:1.目的骨肉瘤是临床上最为常见的恶性骨肿瘤,约占原发恶性骨肿瘤的20%~30%,多发于儿童及青少年。骨肉瘤具有进展迅速、恶性程度较高、预后较差等特点,严重影响患者的生活质量。目前治疗方法主要是采取手术治疗并结合放化疗,使骨肉瘤患者的临床治疗效果有显著提高,但是患者对放化疗不敏感或在放化疗后出现耐药现象仍是治疗的主要障碍。为了更深入的了解骨肉瘤耐药分子及机制,我们以前期工作中成功建立的人骨肉瘤多药耐药细胞系MG63/VCR为研究对象,在基因和蛋白水平上进行研究,为骨肉瘤的治疗寻找新的靶点,也为骨肉瘤多药耐药的进一步治疗提供理论依据。Slingshot(SSH)是Niwa等在果蝇的遗传研究中发现的一个新的基因,在各种组织如脑、甲状腺、心脏、脾脏、肾脏、小肠等广泛表达, SSH1L可能参与下列功能的调节作用:包括细胞定向迁移、有丝分裂、轴突的形成及延伸、生长锥移动性/形态学等。目前关于SSH的研究主要集中在细胞的增殖、迁移等生物活性中的作用及其相关机制,已经证实的SSH调节的蛋白主要有丝切蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(P**4)、钙调神经磷酸酶、PI3K,另外SSH1L同时也是LIMK的磷酸酶。但是关于SSH1L在人骨肉瘤耐药细胞中的表达及与多药耐药之间的关联性尚未见相关报道。本文对SSH1L在人骨肉瘤耐药细胞中的表达及其与耐药之间的关系进行研究,通过siRNA干扰抑制了SSH1L基因的表达,研究SSH1L在MG63/VCR细胞耐药及其相关基因表达、细胞迁移、耐药性中的作用,为骨肉瘤多药耐药的治疗及其逆转寻找新的靶点。2.方法本实验以体外培养的人成骨肉瘤细胞MG63及其长春新碱耐药细胞MG63/VCR为研究对象,采用小剂量的持续诱导方法维持其耐药性。通过RT-PCR技术检测MG63及MG63/VCR细胞中耐药基因MDR1和SSH1基因的表达的变化,通过Westernblot观察SSH1L调节的下游分子丝切因子Cofilin的磷酸化水平的变化;采用基因转染技术过表达及沉默SSH1L基因验证转染效率后,分别通过RT-PCR、细胞划痕实验方法、Transwell细胞迁移实验、CCK-8细胞毒性实验检测MG63/VCR的耐药基因MDR1及其耐药相关基因MRP1、抗凋亡基因Bcl-2的表达、细胞的迁移及耐药性情况。3.结果通过RT-PCR检测MDR1、SSH1L在MG63细胞以及MG63/VCR细胞中的基因表达情况,结果发现MDR1、SSH1L在MG63/VCR细胞中的表达明显高于MG63细胞,二者具有相同的增高趋势;Western Blot检测发现MG63/VCR细胞中Cofilin磷酸化水平显著低于MG63细胞,提示SSH1L的活性增加。骨肉瘤多药耐药细胞MG63/VCR转染过表达质粒pEYFP-SSH1L、siRNA干扰质粒pSUPER-SSH1L,转染效率验证结果发现质粒与脂质体质量体积比为1:2.5时转染效率最高,可达70%~80%左右;沉默SSH1L基因后发现耐药基因MDR1及其耐药相关基因MRP、抗凋亡基因BCL-2表达均明显下降;细胞划痕实验结果显示过表达和沉默SSH1L后与对照组相比,细胞迁移没有明显的变化;经200ng/ml瘦素诱导24小时后,诱导组与未诱导组比较,发现细胞迁移明显增加,而过表达SSH1L诱导组和沉默SSH1L诱导组与对照诱导组比较细胞迁移没有明显差异;Transwell细胞迁移实验结果显示过表达和沉默SSH1L后与对照组相比,细胞迁移数量没有显著差异;我们采用CCK-8法分别检测SSH1L表达增高和降低后MG63/VCR细胞对不同浓度长春新碱的药物敏感性的变化,结果显示沉默SSH1L后MG63/VCR细胞对长春新碱的敏感性增加,而过表达SSH1L后MG63/VCR细胞对长春新碱的敏感性降低。4.结论(1)SSH1L在多药耐药细胞MG63/VCR中过表达,同时正向调节着多药耐药基因MDR1及耐药相关基因MRP、抗凋亡基因BCL-2的表达水平。(2)SSH1L对MG63/VCR细胞的迁移没有促进作用,而瘦素对MG63/VCR细胞具有明显的促进迁移作用。(3)SSH1L的表达与骨肉瘤细胞的耐药性具有显著相关性,可能参与调节骨肉瘤的多药耐药。 关键词:骨肉瘤细胞 多药耐药 Slingshot1L磷酸酶
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  • 前言4-5

论文随机片段:的基因,在各种组织如脑、甲状腺、心脏、脾脏、肾脏、小肠等广泛表达, SSH1L可能参与下列功能的调节作用:包括细胞定向迁移、有丝分裂、轴突的形成及延伸、生长锥移动性/形态学等。目前关于SSH的研究主要集中在细胞的增殖、迁移等生物活性中的作用及其相关机制,已经证实的SSH调节的蛋白主要有丝切蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶