关于试论姜黄姜黄素对动脉粥样硬化家兔内皮祖细胞的影响****毕业********

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试论姜黄姜黄素对动脉粥样硬化家兔内皮祖细胞的影响****毕业********

论文预读:试论姜黄姜黄素对动脉粥样硬化家兔内皮祖细胞的影响****毕业********

  [摘 要] 目的 观察姜黄素对动脉粥样硬化(AS)家兔血浆非对称性二****精氨酸(ADMA)及骨髓血内皮祖细胞(EPCs)的影响。方法 28只家兔分为3组,即对照组(喂食普通饲料)、模型组(喂食高脂饲料)和姜黄素组(喂食高脂饲料+100mg/kg·d-1姜黄素)。12周后,测定血总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL_C)、ADMA水平,计算主动脉内膜斑块面积,取主动脉弓做病理切片,采用密度梯度离心法分离兔骨髓血单个核细胞(MNCs)。用贴壁法测定EPCs黏附能力,改良Boyden小室法测定EPCs迁移能力及CCK_8法测定EPCs的增殖能力。结果 姜黄素组较模型组内膜斑块面积减少,差异有统计学意义(P<0.05),血浆ADMA低,差异有统计学意义(P<0.05),EPCs的黏附、迁移及增殖能力亦明显强于模型组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.05)。结论 姜黄素能降低血脂和血浆ADMA水平,促进粥样硬化兔骨髓血EPCs活力,具有保护血管内皮和抗动脉粥样硬化作用。

  [关键词] 动脉粥样硬化;姜黄素;非对称性二****精氨酸;内皮祖细胞

  1009_816X(2013)04_0279_04

  姜黄素(curcumin)是从姜黄中提取的一种酸性酚类物质,能减轻家兔动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的病变程度,可能在多个环节上影响动脉粥样硬化的发生和发展[1,2]。非对称性二****精氨酸(asymmetricdimethylarginine,ADMA)为一种内源性NO合成抑制剂,SchulzeF等[3]研究认为,其为冠心病(CHD)的一个独立危险因素。内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)是一类能增殖并分化为血管内皮细胞,但尚未表达成熟血管内皮细胞表型,也未形成血管的前体细胞。研究表明,EPCs不仅参与人胚胎血管生成,同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程。近来随着EPCs促进血管新生、修复损伤血管内膜作用的相继揭示,其在冠心病防治上的作用已经越来越受到重视[4,5]。本研究旨在通过复制AS家兔模型,观察其对ADMA及EPCs的影响,探讨姜黄素可能的抗AS机制。

  1 资料与方法

  1 材料与方法:

  1.1 主要材料:日本大耳白家兔由温州医学院动物实验中心提供(浙医动字:2200300002),在实验中心饲养。胆固醇由上海国光生物有

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限公司生产;姜黄素由神威药业有限公司生产;NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所。ADMA标准品,邻苯二甲醛衍生试剂(OPA),3_巯基丙酸、FITC标记的荆豆凝集素I(FITC_UEA_Ilectin)、人淋巴细胞分离液(Ficoll,密度110773)购于Sigma公司,高效液相色谱仪为Agilent1100系列。另备人纤维连接蛋白(Roche公司生产),血管内皮生长因子(PeproTechEC公司生产),培养基M199、胎牛血清、胰酶(Gbico公司生产),DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI_ac_LDL)(Molecularprobe公司生产),CCK28检测试剂盒(上海同仁化学研究所)

  1.2 实验方法:

  1.2.1 实验药品:采用高脂饲料即89%基础饲料、10%猪油、1%胆固醇复制AS动物模型。姜黄素为****粉末,实验前用0.5%羧****纤维素纳(CMC_Na)溶液配成浓度为10g/L的姜黄素/0.5%CMC_Na溶液混悬液(现配现用),供家兔灌胃用。

  1.2.2 AS模型复制和分组:28只2~3个月龄健康雄性日本大耳白家兔,体重1.7~2.1kg。给予基础颗粒饲料适应性喂养1周,随机分为3组:正常对照组、模型组和姜黄素组。正常对照组予喂饲正常饲料,动脉粥样硬化模型组和姜黄素组给予高脂饲料喂养,每只家兔每日进食量均为150g,单笼喂养,饮水不限,连续喂养12周。在喂养过程中,正常对照组和模型组予单纯0.5%CMC_Na溶液10ml/kg体重灌胃,姜黄素组予10g/L的姜黄素混悬液按10ml/kg体重灌胃,每日一次(即100mg/kg·d-1姜黄素)。

  1.2.3 取材:于高脂喂养第12周末,禁食12h,经耳****动脉取血备用。20%乌拉坦20mL/kg腹腔注射,沿腹正中线切开,将主动脉从心脏与主动脉连接的位置及髂动脉分支处剪断,离体后纵向剪开主动脉,予10%中性********溶液固定,待苏丹IV染色及病理检查。

  1.2.4 兔骨髓血EPCs的分离、培养:第12周末双侧胫骨平台穿刺抽取骨髓血,用密度梯度离心法获取单个核细胞,接种于包被有人纤维连接蛋白的24孔培养板中,每孔中加入1ml的M199培养液(含20%胎牛血清、VEGF10μg/L、青霉素1×105U/L、链霉素1×105U/L),置37℃5%CO2饱和湿度培养箱中培养3d后,用Hank液洗掉未贴壁细胞,换培养液继续培养。

  1.2.5 血脂和血浆NO检测:取血2ml,标本经3000rpm,离心15min,取血浆,用全自动生化仪检测血脂指标。TC测定用CHOD_PAP法;LDL_C测定用直接法。采用硝酸还原酶法测定血浆NO含量,步骤严格按照说明书操作进行。

  1.2.6 ADMA的测定:配置浓度为0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、5.0mg/L的ADMA标准品溶液系列,经高效液相色谱分析制作标准曲线。取分装冷冻的血浆1ml,加5_磺基水杨酸去蛋白,离心取上清,经预先配置的OPA衍生试剂衍生后,进样,测定血浆ADMA含量。

  1.2.7 主动脉内膜脂质斑块的观察:取经10%中性********溶液固定12h后的主动脉,水冲10分钟,擦干后放入苏丹IV染液8分钟,斑块部位着色,多媒体彩色病理图文分析系统IMAGINEPRO分别测量斑块面积和主动脉内膜面积,计算斑块面积占内膜面积的百分比。   1.2.8 病理检查:截取0.5cm主动脉弓,石蜡包埋,制作厚5μm切片。HE染色:苏木素、伊红套染常规脱水,树脂封片。

  1.2.9 EPCs的双染色试验:在培养的第6天,将细胞与DiI_ac_LDL(2.4mg/L)一起于37℃避光孵育2h,1%多聚甲醛固定10min,PBS冲洗2次,再加入FITC_UEA_1_lectin(10mg/L)继续避光孵育1h。采用多波长激光共聚焦显微镜观察鉴定双染色阳性的细胞。

  1.2.10 CD34、FlK_1和Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色:分别滴加一抗CD34(1:100),FLK_1(1:100),Ⅷ因子(1:50)过夜,洗涤后滴加1:100二抗,37℃孵育30min。PBS洗2分钟×3次。DAB显色,滴加苏木精染液染色,水溶性封片剂封片保存。随机选取5个200倍视野,计算阳性率。

  1.2.11 体外血管形成实验:冰上操作,将matrigel铺于96孔培养板上(30μl/孔)。置37℃培养箱中孵育1h成胶。消化细胞,并重悬于EGM_2培养液中。调整细胞数为2×108/L。将细胞接种于96孔培养板中(约20000细胞/孔)。置37℃培养箱中,每2h观察血管腔的形成情况。

  1.2.12 EPCs迁移能力的检测:0.25%胰酶_EDTA消化贴壁细胞,制成细胞悬液。将100ul培养液加入改良的Boyden小室的下室,同时在上室注入悬浮2×104个EPCs的培养液150ul。培养24h,刮去滤膜上面的未移动细胞,用甲醇固定,苏木素染色,随机选择5个显微镜视野(×200),计数迁移细胞数。

  1.2.13 黏附能力的测定:各组细胞以0.25%胰酶消化后,制成细胞悬液并计数。再将等量EPCs接种到48孔培养板,置37℃培养箱中培养30min,洗去各孔未贴壁细胞,倒置相差显微镜下随机10个视野(×400)计数重贴壁细胞数。

  1.2.14 增殖能力的测定:CCK28试剂盒检测细胞增殖能力是二****四氮唑溴盐(MTT)法的替代方法。各组细胞以0.25%胰酶消化后,制成细胞悬液,再将等量EPCs接种到96孔培养板,每孔加CCK2810μl,培养4h后,置酶标仪上于450nm处测吸收度A值,参比波长600nm。

  1.3 统计学处理

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