关于试议骨髓间充质干细胞预处理对LPS诱导大鼠DIC模型的器官保护作用-学年论文

专业****毕业论文与职称论文以及期刊发表参考√

试议骨髓间充质干细胞预处理对LPS诱导大鼠DIC模型的器官保护作用-学年论文

论文预读:试议骨髓间充质干细胞预处理对LPS诱导大鼠DIC模型的器官保护作用-学年论文

摘要:研究目的:研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)预处理对脂多糖(LPS)诱导弥漫性血管内凝血(DIC)模型大鼠的器官保护性作用并探讨其机制。研究方法:第一部分:取同种异体Wistar大鼠原代骨髓间充质干细胞进行传代培养。对培养出的骨髓干细胞进行形态观察,考察其增殖能力;通过流式细胞仪对其细胞表型进行鉴定;在特定条件下培养BMSCs向内皮细胞,成骨细胞,脂肪细胞的分化,以证实其潜在可塑性,进一步确定其为BMSCS.第二部分:LPS诱导Wistar大鼠DIC模型的建立。30只成年雄性Wistar大鼠,月龄7周,体重160-170g,分为2组,实验组和对照组各15只,按剂量30mg/kg腹腔内注射异戊巴比妥钠麻醉后,实验组经尾静脉或股静脉缓慢注射2ml LPS (3mg/kg,1小时),而对照组给予等量生理盐水。深麻醉下分别在LPS注射前及注射后4小时和8小时经下腔静脉抽取静脉血,测定以下凝血参数:血小板(PLT)数量,纤维蛋白原(Fib),部分凝血活酶时间(APTT),凝血酶原时间(PT),D-2聚体(D-D)。在LPS注射8小时后处死大鼠。取实验组及对照组大鼠心脏,肝脏,肾脏,肺等主要器官的组织用10%甲醛固定24h,分别行HE染色和Mallory磷钨酸苏木精染色(PTAH染色),显微镜下观察各脏器细胞形态,纤维血栓形成情况,并进行对比;同时计数100个肾小球,观察其中有纤维蛋白微血栓的肾小球所占比例,以判断本组实验LPS能否成功诱导建立DIC模型。第三部分:慢病毒介导GFP转染骨髓间充质干细胞及体内检测。慢病毒载体(PGCL-GFP、 pHelper1.0、 pHelper2.0)包装后获取病毒的上清液保存。取第3代生长状态良好的大鼠BMSC5×104个,分别与0.25、2.5、5、12.5、25感染复数(MOI)的病毒液,在Polybrene液中(8g/m1),32℃,1000g离心2小时,然后种于12孔板培养,每孔含10%FBS的DMEM1.5ml;12h后换液,此后每3天换液1次并观察BMSCs荧光表达情况;第5天每个孔取5个视野计算平均转染率,了解MOI与转染效率的关系,选择最佳MOI。取月龄7周,体重160-170g成年雄性Wistar大鼠10只,经大鼠尾静脉或股静脉注入1m1培养液(含有GFP标记转染5天后BMSCs数量约1×106)共3次,每次间隔24h,第3次注射24h后处死大鼠,取大鼠心脏组织,用10%甲醛固定24h,然后行HE及抗GFP过氧化物酶染色。观察心肌组织内是否有BMSCs存活。第四部分:上述实验成功后,取60只成年雄性Wistar大鼠,月龄7周,体重160-170g,按照BMSCs预处理和LPS注射方案不同分为6组,每组各有大鼠10只。处理组1:1ml培养液(不含BMSCs)注射3次,每次间隔24小时,进行预处理。在最后一次预处理结束后24h,注射1ml LPS(剂量,3mg/kg)o处理组2:1ml培养液(含BMSCs1x103)注射3次,每次间隔24小时,进行预处理。在最后一次预处理结束后24h,注射1ml LPS(剂量,3mg/kg).处理组3:1ml培养液(含BMSCs1x104)注射3次每次间隔24小时,进行预处理。在最后一次预处理结束后24h,注射1ml LPS(剂量,3mg/kg).处理组4:1mI培养液(含BMSCs1x105)注射3次每次间隔24小时,进行预处理。在最后一次预处理结束后24h,注射1ml LPS(剂量,3mg/kg).处理组5:1ml培养液(含BMSCs1x106)注射3次,每次间隔24小时,进行预处理。在最后一次预处理结束后24h,注射1ml LPS(剂量,3mg/kg).对照组:1m1培养液,不含BMSCs,注射3次,每次间隔24小时。在最后一次注射后24h,注射生理盐水1m1(不含LPS)。共6组。分别在LPS(或不含LPS)注入前及注入后4小时和8小时各抽取静脉血,测量以下参数:PLT, Fib, D-2聚体(D-D),APTT, PT,肿瘤坏死因子-α(TNF-α),干扰素-γ(IFN-γ),白细胞介素-1β(IL-1β),肌酐(Cr),丙氨酸转氨酶(ALT),磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB),内皮素(ET)。取心脏,肝脏,肾脏及肺部组织进行HE染色及PTAH染色,检测各器官组织细胞形态及微纤维血栓形成情况。为了进一步证明BMSCs预处理对LPS诱导DIC大鼠的保护作用,我们选择另外60只成年雄性Wistar大鼠,月龄7周,体重160-170g,随机分为三

论文随机片段:射3次,每次间隔24小时,进行预处理。在最后一次预处理结束后24h,注射1ml LPS(剂量,3mg/kg).处理组3:1ml培养液(含BMSCs1x104)注射3次每次间隔24小时,进行预处理。在最后一次预处理结束后24h,注射1ml LPS(剂量,3mg/kg).处理组4:1mI培养液(含BMSCs1x105)注射3次每次间隔24小时,进行预处理。在最后一次预处理结束后24h,注射1ml L